IT4IP核孔膜在誘導(dǎo)脂質(zhì)囊泡膜融合和細(xì)胞內(nèi)遞送的應(yīng)用研究

高分子聚合物薄膜經(jīng)高能重離子輻照后，在薄膜中沿入射離子路徑上會形成圓柱狀損傷區(qū)域，直徑約１０ｎｍ，這些損傷區(qū)域稱作離子的潛徑跡，潛徑跡經(jīng)過化學(xué)蝕刻處理可形成中空通道（孔），即為核孔膜。相比于常規(guī)濾膜，IT4IP核孔膜擁有眾多優(yōu)點(diǎn)，如表面平整光滑、孔徑均一、圓柱形孔形（圖１－１），此外還具有機(jī)械強(qiáng)度高、過濾速度快和截留特性好等優(yōu)點(diǎn)。

核孔膜的生產(chǎn)工藝主要包括輻照、紫外敏化和蝕刻等三個主要步驟。輻照一般利用加速器或者反應(yīng)堆進(jìn)行，目前主要都采用加速器進(jìn)行輻照。紫外敏化主要是改善核孔膜的孔形，讓錐度更小、透氣率更高、孔徑更均勻。化學(xué)蝕刻則決定核孔膜最終孔徑大小

基于IT4IP核孔膜的特點(diǎn)，其應(yīng)用已相當(dāng)廣泛。目前，很多微生物檢測、癌細(xì)胞的檢測以及氣體的檢測都需要用到核孔膜截留取樣。在制藥工業(yè)，核孔膜主要用于藥用水的過濾及終端除菌過濾，血液制品的過濾，空氣與蒸汽的過濾等。在食品飲料行業(yè)，核孔膜用于酒類、飲用水、奶制品、茶飲料等的澄清和除菌過濾，可代替離心法用于分離，或代替熱處理法用于除菌。在電子工業(yè)，可用于制備光刻膠及環(huán)境氣體凈化，以提高電子產(chǎn)品的質(zhì)量和成品率。在化工業(yè)，IT4IP核孔膜用于制備超純試劑及溶劑中貴重的懸浮物和觸媒的回收等。此外，在藥用及化妝品用脂質(zhì)體制劑的研發(fā)和生產(chǎn)中，基于核孔膜的擠出法是脂質(zhì)體粒徑均一化及降低粒徑的方法之一。

本文基于IT4IP核孔膜的擠出法進(jìn)行了兩部分研宄，一是擠出法誘導(dǎo)脂質(zhì)囊泡膜融合并構(gòu)建雜化外泌體，二是基于擠出法的細(xì)胞內(nèi)遞送研究。主要內(nèi)容及結(jié)果如下：

１、擠出法誘導(dǎo)熒光標(biāo)記脂質(zhì)體與空白脂質(zhì)體發(fā)生膜融合。采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移法對膜融合過程進(jìn)行了定性和定量分析，并檢測了膜融合前后脂質(zhì)體粒徑的變化，以凍融法作為對照。結(jié)果顯示，經(jīng)過擠出處理，焚光標(biāo)記脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體發(fā)生了膜融合，也即熒光標(biāo)記磷脂轉(zhuǎn)移到空白脂質(zhì)體，膜融合效率與凍融法相當(dāng)，且耗時較短。相比凍融法，所制得的膜融合脂質(zhì)體粒徑均一。

２、擠出法可誘導(dǎo)熒光標(biāo)記脂質(zhì)體和外泌體發(fā)生膜融合，即構(gòu)建雜化外泌體。首先用透射電鏡對從Ｋ５６２培養(yǎng)上清提取的外泌體進(jìn)行了鑒定，然后利用擠出法誘導(dǎo)熒光標(biāo)記脂質(zhì)體與外泌體發(fā)生膜融合，熒光共振能量轉(zhuǎn)移法對膜融合過程進(jìn)行了定性和定量分析，并檢測了膜融合前后脂質(zhì)囊泡粒徑的變化，以凍融法作為對照。結(jié)果顯示，經(jīng)過擠出處理，焚光標(biāo)記脂質(zhì)體和外泌體發(fā)生了膜融合，但透射電鏡下雜化外泌體仍然保持了典型的茶托結(jié)構(gòu)。擠出法的膜融合效率稍低于凍融法，但其具有耗時短的優(yōu)點(diǎn)。此外，擠出法制備的雜化外泌體具有較均勻的粒徑，而凍融法構(gòu)建的雜化外泌體則粒徑及粒徑分布范圍都變大。

３、基于IT4IP核孔膜的擠出法可通過誘導(dǎo)ＣＴ２６細(xì)胞變形及細(xì)胞膜短暫穿孔而將介質(zhì)中各種大分子遞送進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)擠出處理的ＣＴ２６細(xì)胞仍可正常貼壁生長及增殖。膜孔徑和遞送材料的分子量是影響遞送效率的重要因素。不同分子量右旋糖酐經(jīng)擠出遞送后，在細(xì)胞漿和細(xì)胞核都有分布，但是質(zhì)核比與分子量呈正相關(guān)。

４、基于IT4IP核孔膜的擠出法可通過誘導(dǎo)Ｋ５６２細(xì)胞變形及細(xì)胞膜短暫穿孔而將介質(zhì)中各種大分子遞送進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)擠出處理的Ｋ５６２細(xì)胞任可正常生長及增殖。膜孔徑和遞送材料分子量是影響遞送效率的重要因素。此外，不同分子量的右旋糖酐經(jīng)擠出遞送后，在細(xì)胞漿和細(xì)胞核都有分布，水合半徑大于核膜復(fù)合體被動擴(kuò)散尺度上限的２ＭＤａ右旋糖酐主要在擠出處理后起初的１小時內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞核，這強(qiáng)烈提示擠出處理誘導(dǎo)了核膜破裂，從而允許其進(jìn)入細(xì)胞核。